Western Blot Troubleshooting Guide

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Western Blot Troubleshooting 원인 및 해결 방안

	원 인	해 결 방 안
High Background	불충분한 Pre-blocking	Blocking Buffer 의 농도를 높이거나, 처리 시간 연장 (최소 RT 1시간 처리 or 4°C O/N 처리 권장)
		Blocking Buffer 에 Tween-20 을 넣지 않았다면, 최대 농도 0.05%까지 되도록 Tween-20 첨가
		Antibody Diluent 준비 시, Tween-20 이 들어간 Buffer 사용
	과도하게 높은 농도의 Antibody 처리	Antibody의 희석 배율 높이기
	Blocking Buffer의 호환성 문제	다른 종류의 Blocking Buffer 를 사용
	Antibody 의  Cross-reactivity 발생 (Antibody가 Blocking Buffer 에 존재하는 특정 Protein 에 대해  Cross-reactivity 를 일으킨 경우)	Avidin-biotin System 을 사용할 경우, Milk Base-blocking Buffer는 권장하지 않음
		Antibody와 Blocking Buffer 간의 Cross-reactivity 를 확인하기 위해, Blocking Buffer Incubation 후 ECL 로 감광 테스트 진행 (Antigen 사용 X)
		HRP (2’Ab) 의 희석 배율 높이기
	Washing의 효율	Washing 횟수 늘리기, Washing Buffer 의 Volume 높이기
		Washing Buffer에 Tween-20을 넣지 않았다면, 최대 0.05% 농도가 되도록 Tween-20 첨가 (농도가 0.05% 보다 높을 경우 Membrane 상의 단백질 샘플에 영향을 줄 가능성 있음)
	장시간의 Film 노출	Film 노출 시간 줄이기
		Signal Sensitivity가 너무 낮아 Film 감광 시간을 길게 한 것이라면, Antibody나 ECL Substrate 의 조건을 바꾸기
	Membrane Problem	실험 중 Membrane이 마르지 않도록 주의 맨 손으로 Membrane 만지지 않기
	Buffer 오염	사용하는 Buffer 가 Contamination 되지는 않았는지 확인 (만약 이 경우라면, 반드시 새 Buffer 사용)

	원 인	해 결 방 안
No Bands	낮은 Antibody 농도,   짧은 반응 시간	Antibody 희석 배율 낮추기 처리 시간 연장(4°C O/N)
	낮은 Sample 발현 양	샘플 당 단백질의 양이 50 ug되도록 증량
	Transfer 문제	Ponceau S로 Transfer가 제대로 됐는지 확인(Transfer가 반대방향으로 됐을 가능성)
	과도한 Washing	Washing 횟수 또는 시간 낮추기
	Sodium Azide에 의해 억제된 2’Ab	HRP Conjugated Antibody는 Sodium Azide와 함께 사용 금지
	ECL 문제	고감도의 ECL Solution으로 변경

	원 인	해 결 방 안
White Blank	Transfer 문제	Transfer Casette 제작 시 Membrane과 Gel 사이 Bubble 제거

	원 인	해 결 방 안
Smiling Bands	높은 전기영동 전압	전압 낮추기
	Gel 중합 반응 불충분	Gel 중합 반응 시간 증가
	불균일한 Sample Volume	Sample Loading 시 Well마다 동일한 양의 Sample Volume

	원 인	해 결 방 안
Smeared Bands	Particulates 오염	Centrifuge를 통한 Particulates 제거
	Sample Overload	적정량의 Sample Volume 사용
	Gel 중합 반응 불충분	Gel Components를 섞고 일정 시간 후 Gel 제작 TEMED와 APS 사용량 조정
	높은 전기영동 전압	전압 낮추기
	유효기간이 지난 Precast Gel 사용	유효기간 내에 Precast Gel 사용

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* Western blot 실험 방법에 관한 상세한 설명은 아래 링크 참조 부탁 드립니다.

[Technote]Western Blot -1편 : 네이버 블로그 (naver.com)