[Cell Signaling Technology] InTraSeq™ Single Cell Analysis
Seq What You’ve Been Missing
InTraSeq은 CST가 개발한 혁신적인 기술로, 단일 실험에서 신호전달 경로를 식별하고 질병 발달의 분자적 기전을 밝혀냅니다. 이 기술은 수천 개의 세포에서 RNA뿐만 아니라 세포 내 및 세포 표면 단백질을 동시에 검출할 수 있어, 연구자가 단일 세포 수준에서 전사체와 함께 신호전달 경로를 조사할 수 있도록 합니다.
InTraSeq는 세포 생물학에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 합니다:
– 기존의 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 방법으로는 밝혀지지 않았던 생물학적 통찰을 제공
– 단일 세포 데이터셋에서 전사와 번역 간의 역동성을 강조
– 단일 세포 수준에서 번역 후 변형(post-translational modifications, PTMs)을 정량화하여 세포 신호전달 기전을 해부
InTraSeq 3′ 기술은 CST에서 개발 및 검증되었으며, 10x Genomics Chromium Single Cell 3′ Reagent Kit와 Feature Barcoding 기술을 활용하여 구현됩니다.
What makes InTraSeq unique?
A) 현재 사용 가능한 대부분의 단일 세포 분석 기술은 RNA를 검출하고, 표면 단백질을 표현형 분석 목적으로 측정하기 위해 바코드가 부착된 항체를 사용합니다.
B) 세포 내 단백질을 검출하는 방법을 개발하려는 시도가 많았지만, 이러한 방법은 일반적으로 RNA 손실과 분해가 심각한 문제가 됩니다.
C) InTraSeq™ Single Cell 분석은 RNA를 보존하면서 세포 내 및 세포 표면 단백질을 함께 검출할 수 있습니다.
현재 사용 가능한 대부분의 단일 세포 분석 기술은 RNA 검출과 일부 표면 마커 발현 수준 분석에 국한되어 있어, 샘플의 표현형 분석에만 초점을 맞추고 있습니다. 또한, 기존 기술은 질병 상태에서 활성화되는 주요 신호전달 경로나 약리학적 자극에 의해 유도되는 신호 전달 경로를 측정하거나 결정할 수 없습니다.
InTraSeq 기술은 전사체, 단백질, 그리고 번역 후 변형(PTM) 정량화를 단일 실험에서 통합하여 수행함으로써, 단순한 표현형 분석을 넘어 세포 간의 메커니즘적 차이를 심층적으로 분석할 수 있도록 합니다. 이를 통해 연구자는 여러 신호전달 경로와 유전자 발현 변화를 동시에 탐색하여 생리학적 반응의 핵심 분자 기전을 효율적으로 규명하고, 하위 단백질 변형을 분별할 수 있습니다.
단일 세포 분석(SCA)을 통한 세포 내 단백질 및 번역 후 변형 연구
scRNA-seq은 일반적으로 약리학적 및 환경적 변화에 대한 세포 반응을 분석하는 데 활용됩니다. 그러나 단백질 발현 수준은 RNA 발현과 직접적으로 연관되지 않는 경우가 많아, 복잡한 생리학적 시스템을 완전히 이해하는 데 한계가 있습니다. 단일 세포 수준에서 단백질 발현과 번역 후 변형이 유전자 발현과 어떻게 다르게 나타나는지를 분석하면, 기존 scRNA-seq만으로는 확인할 수 없는 신호전달 경로 활성화에 대한 기능적 통찰을 얻을 수 있습니다.
번역 후 변형(PTMs)은 단백질의 활성, 수명, 그리고 발현 수준을 변화시킬 수 있습니다. 유전자 발현과 단백질 활성 간의 상호작용을 이해하는 것은 세포 이질성과 복잡한 생물학적 시스템의 기능적 상태를 규명하는 데 필수적입니다.
InTraSeq 3′ Conjugate Antibody Cocktail은 PTM을 포함하여 인간과 마우스 타겟에 결합하는 31개의 주요 항체로 구성되어 있습니다.
이를 통해 연구자는 단일 실험에서 여러 핵심 신호 단백질을 편향 없이 정량화할 수 있습니다.
단일 세포 PTMs 및 mRNA의 동시 정량화
RNA 발현 수준이 유사한 세포라도, 일부는 약리학적 또는 환경적 변화 이후 최종적으로 발현되는 단백질의 유형이나 활성화된 번역 후 변형이 다를 수 있습니다. RNA, 단백질 및 번역 후 변형을 동시에 정량화함으로써, RNA 발현만으로는 규명할 수 없는 복잡한 생리학적 상호작용을 보다 철저하게 이해할 수 있습니다.
RNA Does Not Necessarily Correlate with Protein Levels
mRNA 및 단백질 발현 수준 간의 관계를 나타내는 산점도 그래프
산점도 그래프는 mRNA와 단백질 발현 수준을 나타냅니다. InTraSeq를 이용한 mRNA 및 세포 단백질의 동시 정량 분석은 mRNA와 단백질 발현 수준이 반드시 일치하지 않으며, 두 값이 종종 불일치함을 보여줍니다.
InTraSeq™ Single Cell 분석의 장점
간소화된 워크플로우로 실험 시간 단축
InTraSeq™ 3’ Assay Kit는 간소화된 프로토콜을 통해 최소한의 실험 시간으로 강력한 mRNA 및 단백질 신호를 제공합니다. 또한, 두 개의 중간 정지 지점을 포함하여 샘플을 최대 7일 동안 보관할 수 있어 실험 일정에 대한 유연성을 극대화합니다.
InTraSeq 프로토콜은 실험대에서 직접 다뤄야 하는 시간이 약 1시간 정도이며, 실험을 수행하는 동안 최대한의 시간적 유연성을 제공합니다. 특히 고정화(fixation) 단계 이후 샘플을 최대 7일 동안 보관할 수 있어 RNA의 안정성을 유지하면서도, 기존 단일 세포 분석 프로토콜에서 필수적으로 요구되던 하루 종일 걸리는 작업 일정을 조정할 필요가 없습니다. 또한, 샘플을 장기간 보관할 수 있어 high-throughput 응용에서 여러 날에 걸쳐 샘플을 순차적으로 처리하는 것이 가능하며, 분석 품질을 유지하면서도 대량 샘플 처리를 용이하게 합니다.
간단한 면역 염색 프로토콜의 4단계
1. 세포 고정(Fixation) – Overnight
실험 시간: ~5분
세포는 최대 7일 동안 냉동 보관 가능
2. scBlock 처리 – Incubation
실험 시간: ~10분
RNA 및 단백질의 단일 세포 분석을 위한 최적화된 단계
3. CST® InTraSeq™ 3’ Conjugate Antibody Cocktail 첨가 및 Overnight 배양
실험 시간: ~5분
4. 세포 세척(Wash) 단계
실험 시간: ~20분
이 단계 이후, 세포는 10x Genomics 3′ 단일 세포 실험을 수행할 준비가 완료
RNA 신호 보존과 세포 내 단백질 신호전달 연구
single-cell multiomic experiments에서 RNA의 무결성을 유지하는 것은 지속적인 도전 과제였습니다. 많은 단일 세포 분석법은 막을 파괴하는 강력한 화학 물질을 사용하여 RNA가 분해되고 손실되는 문제를 유발합니다. InTraSeq 시약은 세포 및 핵막을 부드럽게 투과하도록 최적화되어, 결합된 항체가 세포 내로 들어가 표적 단백질과 결합하는 동시에 RNA 수준을 실험 전체에서 유지할 수 있도록 합니다. 이를 통해 RNA 및 단백질 발현을 정확하게 정량화할 수 있습니다.
InTraSeq™ 시약을 사용한 샘플에서 전사체 보존 효과
InTraSeq 처리된 PBMC 샘플과 살아있는 PBMC 샘플의 전사체 비교
InTraSeq 시약은 PBMC(말초 혈액 단핵세포)와 같은 어려운 샘플에서도 살아있는 세포의 유전적 프로파일을 유지하면서 mRNA 손실을 최소화합니다. 아래 표는 살아있는 PBMC 샘플과 InTraSeq 처리된 PBMC 샘플 간의 비교 결과를 보여줍니다.
| 항목 | 살아있는 PBMC | InTraSeq™ PBMC |
| 상대적인 세포당 중간 유전자 수(일치하는 리드/세포) | 100% | 86.2% |
| 세포 내 리드 비율 | 94.9% | 85% |
| 세포 내 항체 리드 비율 | N/A | 60% |
| 유전체에 안정적으로 mapping된 reads | 89.9% | 85.5% |
InTraSeq 단일 세포 분석 기술의 강점은 단일 세포 유전자 발현과 함께 세포 내 및 세포 표면 단백질을 동시에 검출하고 정량화하여 이질적인 세포 집단을 구별할 수 있다는 점에 있습니다.
CITE-seq과 달리, InTraSeq는 세포 표면 단백질만을 검출하는 것이 아니라, 연구자들이 편향 없이 복잡한 세포 내 신호전달 경로를 연구할 수 있도록 도와줍니다.
InTraSeq 처리 전후 PBMC 샘플의 UMAP 시각화
InTraSeq 프로토콜을 적용하기 전후의 PBMC 샘플을 비교한 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 시각화. 동일한 기증자로부터 채취한 PBMC 샘플에서 InTraSeq 프로토콜을 적용하기 전후의 세포 유형 비율이 일관되게 유지됨을 확인할 수 있습니다. 이는 InTraSeq 프로토콜이 mRNA 보존에 영향을 미치지 않으며, 원래의 세포 이질성을 유지하는 데 효과적임을 보여줍니다.
단일 실험에서 Multiple Molecular Mechanisms 탐색
CST의 세포 내 신호전달 및 번역 후 변형 항체 전문성과 결합된 InTraSeq 기술은 연구자가 세포 내, 핵, 및 표면 단백질 상호작용을 유전자 발현과 함께 연구하고 정량화할 수 있도록 합니다. 전사체 변화와 단백질 발현(번역 후 변형 포함)을 동시에 측정하면, 기존 분석법으로는 불가능했던 방식으로 복잡한 신호전달 시스템에 대한 보다 포괄적인 데이터 세트를 생성할 수 있습니다. 이를 통해 질병 기전에 대한 심층적인 이해를 제공할 수 있습니다.
단일 세포 단백질 분석을 활용한 CD4+ 및 CD8+ 세포 상태 식별
InTraSeq 분석법을 활용하여 CD4+ 및 CD8+ 세포의 신호전달 경로 및 세포 내 단백질을 측정하여 RNA 기반 분석만으로는 연구하기 어려운 세포 상태를 식별할 수 있습니다. 단일 세포 수준에서 번역 후 변형과 세포 내 단백질 수준을 측정함으로써, 질병 발생 기전에 대한 보다 깊이 있는 이해를 가능하게 합니다.
InTraSeq™ 3′ Conjugate Antibody Cocktail에는 검증된 31개의 항체가 포함되어 있으며, 이 중 2개는 표면 단백질을 타겟으로 하고 나머지 29개는 번역 후 변형(PTMs)을 포함한 세포 내 단백질을 타겟으로 합니다. 이 항체 조합은 면역학 및 암 연구에서 흔히 연구되는 신호전달 경로의 단백질을 편향 없이 정량화할 수 있도록 설계되어 있으며, 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터 세트를 제공합니다.
Phospho-Stat3 (Ser727) 및 Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Tyr202/Tyr204) 히트맵
PBMC(말초 혈액 단핵 세포)를 LPS로 자극한 후 InTraSeq™ Assay Kit를 이용하여 처리하였으며, RNA, 총 단백질, 및 번역 후 변형(PTMs)을 scRNA-seq과 InTraSeq™ 3′ Conjugate Antibody Cocktail을 사용하여 정량화하였습니다. 히트맵은 Stat3 및 MAPK의 PTM 수준 변화를 자극 전후로 나타내며, 이러한 인산화 수준 변화가 RNA 및 단백질과 어떻게 상관관계를 가지는지를 시각적으로 보여줍니다.
InTraSeq는 연구에 어떻게 기여할 수 있을까?
InTraSeq는 연구의 초기 단계에서 강력한 선별(screening) 도구로 활용될 수 있습니다. 연구자가 특정 유전적 표현형(genetic phenotype)을 이해하는 데 도움을 주며, 편향 없는 접근 방식을 통해 어떤 신호전달 경로가 변화했는지를 밝혀내 연구의 초점을 어디에 맞춰야 할지 결정하는 데 기여할 수 있습니다.
또한, InTraSeq는 단일 세포에서 RNA만으로는 관찰할 수 없는 급성 세포 변화를 측정할 수 있습니다. PTM 반응은 mRNA 발현보다 먼저 발생하며, 매우 짧은 시간(20분 미만) 내에 이루어지므로, 이러한 급성 반응은 RNA 기반 분석만으로는 검출할 수 없습니다. 이 점이 InTraSeq 기술의 중요성과 독창성을 더욱 강조하는 요소입니다.
신뢰할 수 있는 CST 검증 InTraSeq™ 3′ Conjugate Antibody Cocktail
CST에서 모든 InTraSeq 항체 및 시약을 엄격하게 검증하고 최적화하여 일관되고 고품질의 결과를 제공합니다. InTraSeq™ 3′ Conjugate Antibody Cocktail은 모든 포함된 항체와 시약이 최적의 농도로 조제되어 있으며, 즉시 사용할 수 있도록 준비되어 있습니다.
InTraSeq는 실험 최적화에 많은 시간을 들일 필요 없이 연구자가 신뢰할 수 있는 데이터를 수집할 수 있도록 하며, 불필요한 시행착오를 줄이고 보다 효율적인 연구 수행을 가능하게 합니다.
InTraSeq™ Single Cell 분석 제품 구성
InTraSeq™ 3′ Conjugate Antibody Cocktail
– 면역학 및 암 연구에서 자주 연구되는 신호전달 경로 단백질에 대한 31개의 1차 항체 포함
– 인간(H) 및 마우스(M) 샘플과 반응
– 단일 세포 분석을 위해 특별히 조제된 버퍼 키트
– InTraSeq™ 3′ Conjugate Antibody Cocktail 1(인간 및 마우스 reactive) 포함된 31개 항체 외에도 추가로 7개의 인간 반응성 InTraSeq™ 3′ Conjugates 개별 제공
| Surface Targets | Species Reactivity | Included in Cocktail? |
|---|---|---|
| CD3 (UCHT1) Mouse mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3028) | H | No |
| CD4 (RPA-T4) Mouse mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3029) | H | No |
| CD8α (SK1) Mouse mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3030) | H | No |
| CD19 (Intracellular Domain) (D4V4B) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3010) | H, M | Yes |
| CD68 (D4B9C) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3012) | H | No |
| NCAM1 (CD56) (E7X9M) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3025) | H, M | Yes |
| T-bet/TBX21 (D6N8B) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3009) | H | No |
| Intracellular Targets (non-PTM) | Species Reactivity | Included in Cocktail? |
|---|---|---|
| Aiolos (D1C1E) Rabbit mAb #15103 (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3027) | H, M | Yes |
| FoxO1 (C29H4) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3037) | H, M | Yes |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3007) | H, M | Yes |
| Iba1/AIF-1 (E4O4W) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3003) | H, M | Yes |
| Ikaros (D6N9Y) Rabbit mAb #14859 (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3026) | H, M | Yes |
| NFAT1 (D43B1) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3032) | H, M | Yes |
| S100A9 (D5O6O) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3004) | H | No |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3013) | H, M | Yes |
| Vimentin (D21H3) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3011) | H, M | Yes |
| PTM-related Targets | Species Reactivity | Included in Cocktail? |
|---|---|---|
| Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3021) | H, M | Yes |
| Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3018) | H, M | Yes |
| Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3014) | H, M | Yes |
| CREB (48H2) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3008) | H, M | Yes |
| Phospho-CREB (Ser133) (87G3) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3006) | H, M | Yes |
| Glucocorticoid Receptor (D6H2L) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3035) | H, M | Yes |
| Phospho-Glucocorticoid Receptor (Ser226) (D9D3V) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3036) | H, M | Yes |
| Acetyl-Histone H3 (Lys27) (D5E4) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3020) | H, M | Yes |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3024) | H, M | Yes |
| Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3017) | H, M | Yes |
| NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3033) | H, M | Yes |
| Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3034) | H, M | Yes |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) (137F5) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3016) | H, M | Yes |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (197G2) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3023) | H, M | Yes |
| S6 Ribosomal Protein (54D2) Mouse mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3005) | H, M | Yes |
| Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3019) | H, M | Yes |
| Stat1 (D1K9Y) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3038) | H, M | Yes |
| Phospho-Stat1 (Ser727) (D3B7) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3039) | H, M | Yes |
| Stat3 (124H6) Mouse mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3022) | H, M | Yes |
| Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3015) | H, M | Yes |
| Phospho-Stat3 (Ser727) (D4X3C) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3031) | H, M | Yes |
| Isotype Control | Species Reactivity | Included in Cocktail? |
|---|---|---|
| Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3001) | H | No |
| Controls Included In Assay Kit (not for individual sale) | Species Reactivity | Included in Cocktail? |
|---|---|---|
| Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3002) | H, M | No |
| Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (InTraSeq™ 3′ Conjugate 3000) | H, M | No |
