[Cell Signaling Technology] IHC
IHC (Immunohistochemistry)
: 특이적인 항원-항체 결합을 기반으로 하여 조직 또는 세포내 특정 항원의 존재유무 및 존재위치를 알아내기 위해 사용하는 방법
* 질병 진단, 약물 개발, 생물학적 연구 등에 사용됨
* IHC Protocol
1. Immunostaining
a. Quench – 3% H2O2를 사용하여 endogenous peroxidase activity 제거 (HRP 기반 detection 시)
b. Blocking – antibody가 tissue에 비특이적으로 결합하는 것을 방지
c. Primary Antibody Incubation – target에 결합하기 위해 diluent가 포함된 primary antibody 추가
d. Washing – 결합하지 않은 물질을 제거
* 적절한 washing는 낮은 background와 높은 signal을 대조하는 데 중요
2. Detection
a. Detection system – target을 검출하기 위해 secondary antibody 를 추가.
b. Washing – 결합하지 않은 secondary antibody 제거
3. Dehydration, Mounting & Examination
Slide 절편의 보존과 최적의 signal detection을 위해 slide와 coverslip mounting. 수성 및 비수성(영구적) mounting media 사용 가능
* 일반적으로 사용되는 chromogen과 mounting media
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Chromogen
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Color
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Mounting Media
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DAB
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Brown
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Nonaqueous or Aqueous
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AEC
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Red
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Aqueous
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NovaRed™
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Red
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Nonaqueous
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* Paraffin Embedded vs Frozen Embedded
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Paraffin Embedded
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Frozen Embedded
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Fixation
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Pre-embedding
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Pre/post-sectioning
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Sectioning
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Microtome
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Cryostat
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Storage
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실온에서 수년간 보관 가능
(시간이 지나면서 항원이 변질 가능성)
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-80°C에서 1년 보관 가능
(-190°C에서 조금 더 오래 보관 가능)
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Advantages
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조직 형태 보존
비교적 얇은 박절 가능 (6±2 um)
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Enzyme & Antigen 기능 보존
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Downstream protocol
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PCR 증폭을 위한 DNA 와 RNA
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DNA, RNA, FISH 나 Cell Cycle 분석을 위한 Free Nuclei
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Precaution
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Paraffin block을 만들 때 온도/시간 주의
일부 항원이 변형되어 염색되지 않을 수 있음
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조직에서 얼음결정이 형성되는 것을 주의
Cryostat의 온도는 -20°C에 맞춰진 상태에서 박절
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* Reagents
Buffer Reagents
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Product name
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Cat.No
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Normal Goat Serum
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#5425
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Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X)
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#9997
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Tris Buffered Saline (TBS-10X)
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#12498
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Phosphate Buffered Saline with Tween® 20 (PBST-20X)
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#9809
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Phosphate Buffered Saline (PBS-20X)
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#9808
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Detection Systems and Substrate
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Product name
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Cat.No
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SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse)
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#8125
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SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit)
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#8114
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SignalStain® DAB Substrate Kit
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#8059
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Antibody Diluent
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Product name
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Cat.No
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SignalStain® Antibody Diluent
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#8112
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IHC Kits
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Product name
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Cat.No
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SignalStain® Akt Pathway IHC Sampler Kit
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#8107
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SignalStain® Phospho-ErbB Family IHC Sampler Kit
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#8111
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SignalStain® Proliferation/Apoptosis IHC Sampler Kit
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#8109
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SignalStain® Phospho-Stat IHC Sampler Kit
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#8113
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SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit
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#12692
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Controls
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Product name
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Cat.No
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Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control
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#3900
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Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control
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#5415
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SignalSlide® Phospho-Akt (Ser473) IHC Controls
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#8101
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SignalSlide® Cleaved Caspase-3 (Asp175) IHC Controls
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#8104
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SignalSlide® Phospho-EGF Receptor IHC Controls
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#8102
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SignalSlide® Phospho-ErbB Family IHC Controls
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#8117
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SignalSlide® HER3/ErbB3 IHC Controls
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#12128
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SignalSlide® Phospho-Met (Tyr1234/1235) IHC Controls
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#8118
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SignalSlide® NF-κB p65 IHC Controls
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#12873
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SignalSlide® Phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) IHC Controls
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#8103
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SignalSlide® PTEN IHC Controls
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#8106
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SignalSlide® Phospho-Stat1/3/5 IHC Controls
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#8105
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