[Cell Signaling Technology] CUT&RUN
2023-09-14
ChIP-seq
: DNA 결합 단백질의 상호작용을 분석하고 단백질 결합부위의 유전자를 확인하기 위해 사용하는 실험으로, 차세대염기서열분석법 (NGS) 과 크로마틴면역침강법 (Chromatin Immunoprecipitation; ChIP) 을 결합한 방법.
많은 양의 샘플이 필요하고 분석 가능한 Target이 한정적이라는 한계점 보유.
CUT&RUN
(Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease)
: Native Chromatin에서 Protein-DNA complex를 분리하기 위해 Target-specific Primary Antibody와 pAG-MNase를 활용하는 새로운 기술.
* 장점
– Histone, Transcription Factor, Cofactor 분석 가능.
– 실험에 필요한 샘플양이 적음.
– 짧은 실험 기간 (1~2일 소요)
– Target Protein 과 결합된 DNA 만 특이적으로 Fragmentation 하기 때문에 낮은 Background.
– 손상되지 않은 세포나 핵에서 실험을 진행하기 때문에 기존의 ChIP에서 적용할 수 없었던 항체도 효과적으로 적용 가능.
* The Benefit of CUT & RUN
| Benefit | Feature | Work Impact |
| Low Sample Requirement | Only 100k Cells Needed | Time and Resource Savings on Tissue Culture |
| Fast Time to Results | 1 to 2 Days From Cell To DNA | Time Saving |
|
Sequencing Cost Savings
|
Only 3 to 5 Million High-quality Reads Required
(Compared to 10-35 Million)
|
More Samples Sequenced per Lane |
| Target Versatility |
Generate Seq and/or qPCR Data for Histones, Histone Mods,
TFs & Cofactors
|
Streamlined Workflow |
| Antibody Versatility | Compatible With Rabbit and Mouse Antibodies |
Not Limited to Rabbit Abs
(Chip Does Not Work Well with Mouse Monos)
|
| Reproducible Results | Spike-in Control DNA to Normalize Signal between Samples | Confidence |
| Avoid “Crosslinking” Artifacts | An In vivo Method Performed Using Native Chromatin | Time Savings, Confidence |
CUT & RUN Method Overview
(1) Ab & pAG-MNase binding:
1. Buffer&Reagent Exchange 를 위해 세포를 Concanavalin A 으로 고정.
2. Primary Antibody와 pAG-MNase Fusion Enzyme이 핵으로 유입되는 것을 촉진시키기 위해 Digitonin으로 Cell Membrane Permeabilization.
3. Target-specific Primary Antibody는 Antibody와 Fusion Enzyme의 pAG Domain의 Protein-protein 상호작용을 통해 pAG-MNase 을 Chromatin에 위치하게 함.
(2) MNase Digestion:
4. Ca2+를 첨가하면 pAG-MNase가 활성화되는데, 이를 통해 Chromatin이 Fragmentation 되고 세포 밖으로 Release.
(3) DNA Purification:
5. DNA Purification Spin Column 이나 Phenol/Chloroform Extraction을 통해 DNA를 정제하고 Ethanol Precipitation을 수행. (정제되고 농축된 DNA는 NG-seq의 qPCR을 통해 Idenfication/Quantification)
