[Cell Signaling Technology] CST Antibody Validation-II

2023-01-27

Antibody specificity를 확인하기 위해 Positive/Negative Cell에서 Antibody Performance를 비교

Fig. 1 HCT 116 Cell에서 Anti-Thymidine Kinase 1(green)을 사용한 ICC 분석

Antibody working condition을 최적화하기 위해 Expression Level 이 잘 알려진 Cell Line이나 Tissue을 이용해 Antibody Signal 강도 분석

Fig. 2 Paraffin-embedded HT-29 Cell Pellet에서 Anti-RRM2를 사용한 IHC 분석

기존 Antibody Validation Data를 Cross-referencing 하기 위해 Antibody assay가 아닌 Omics, in situ hybridization 및 RNA sequencing 등의

독립적인 검증(non-antibody-based Method)을 통해 Antibody Signal과의 상관 관계 확인

Fig. 3 Western Blot Data(left)와 RNA Normalized Expression(right)

동일 Target Protein에 대해 같은 Antibody Performance를 나타낸다는 것을 확인하기 위해 같은 Target Protein의

Non-overlapping Epitope을 Detection하는 다양한 Antibody들과의 Signal 비교

Fig. 4 Paraffin-embedded Human Squamous Cell Lung Carcinoma에서 서로 두 가지의 Anti-MAGE-A4를 사용한 IHC 분석

발현이 낮거나 Endogenous System에서 확인되지 않는 Target Protein도 Validation 하기 위해 Recombinant Protein이나 Heterologous Expression 사용

Ex) Protein Isoform이나 Conserved Family Member들간의 Antibody Cross-reactivity를 확인

Fig. 5 GST-tagged PKC isoform에서 PKCδ(D10E2)(upper)와 GST(91G1)(lower) 를 사용한 WB 분석.

아홉가지 Isoform 중에서 δ 에만 특이적으로 결합하며 다른 Recombinant Isoform에 대해 Off-target Binding 하지 않는 것을 확인.

Antibody Specificity 또는 Function에 관한 정보를 보완하기 위해 Competitive ELISA, Peptide Dot Blots, Peptide Blocking, Protein Array를 사용

Fig. 6 Competitive ELISA를 사용하여 N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) Specificity 확인

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